PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，可用于擴(kuò)增DNA序列。在PCR反應(yīng)中，引物是起關(guān)鍵作用的短鏈DNA分子，它們會(huì)與待擴(kuò)增DNA序列的兩端匹配，指示聚合酶在這些位置開(kāi)始復(fù)制DNA。
引物在PCR反應(yīng)中的作用為以下幾個(gè)方面：
1. 引物定義PCR擴(kuò)增的目標(biāo)序列： PCR擴(kuò)增需要在待擴(kuò)增DNA序列的兩端放置引物，引物的選擇和設(shè)計(jì)可以確保PCR擴(kuò)增特定的DNA序列。引物的序列應(yīng)該能夠與待擴(kuò)增DNA序列的兩端互補(bǔ)匹配，以便在PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。
2. 引物促進(jìn)DNA序列的復(fù)制：
一旦引物與待擴(kuò)增DNA序列的兩端匹配，聚合酶就會(huì)沿著DNA模板鏈復(fù)制新的DNA鏈。引物的序列決定了聚合酶的起始位置和方向。
3. 引物控制PCR反應(yīng)的特異性：
引物的選擇和設(shè)計(jì)可以控制PCR反應(yīng)的特異性，以避免非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等特性會(huì)影響引物的特異性。
4. 引物影響PCR反應(yīng)的效率：
引物濃度、長(zhǎng)度、Tm值等因素也會(huì)影響PCR反應(yīng)的效率和產(chǎn)量。正確的引物濃度和設(shè)計(jì)可以確保PCR反應(yīng)的高效率和特異性。
PCR引物設(shè)計(jì)方法：
通常來(lái)說(shuō)，引物的設(shè)計(jì)需要遵守一些基本的原則。這些原則很細(xì)，很多，也很繁瑣。但實(shí)際上對(duì)于常規(guī)的引物，并不需要考慮太多，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯桑嗟那闆r下需要靈活選擇。一般來(lái)說(shuō)，引物設(shè)計(jì)需要遵循以下原則：
1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。
3. 引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)。
6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的ΔG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。
8. 對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
但是在實(shí)際設(shè)計(jì)過(guò)程中，往往很難同時(shí)滿足以上條件，因此只需要在設(shè)計(jì)引物時(shí)盡可能滿足即可，沒(méi)必要太過(guò)糾結(jié)。
同時(shí)需要注意，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一，具體情況需要具體看待。有的模板本身GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
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