抗體（antibody，Ab）是機(jī)體在體內(nèi)存在的外來(lái)分子、微生物等抗原物質(zhì)刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig），主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中。抗體特異性鑒定是免疫化學(xué)技術(shù)中，確?？乖?抗體反應(yīng)專一性的基礎(chǔ)。從根本上驗(yàn)證特異性，投稿國(guó)際期刊，常常需要準(zhǔn)備這方面數(shù)據(jù)。
抗體特異性結(jié)合抗原的原理：抗體由V區(qū)和C區(qū)組成，其中的V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region, CDR）可組成抗原結(jié)合槽，抗原結(jié)合槽可以與相應(yīng)的抗原表位以鎖-匙（key-lock)互補(bǔ)關(guān)系進(jìn)行特異性識(shí)別與結(jié)合（如下圖）。因此不同V區(qū)的抗體可識(shí)別并結(jié)合不同的抗原。
鑒定抗體的特異性有四種基本方法：分子遺傳法、獨(dú)立抗體驗(yàn)證法、正交法和標(biāo)簽蛋白法。四種方法并非必須同時(shí)采用。通常，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和研究設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，選擇對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)具有說(shuō)服力的1到2種即可。
1、分子遺傳法。
對(duì)于遺傳編碼清楚的蛋白質(zhì)，可采用分子遺傳學(xué)技術(shù)（基因敲除模型、CRISPR-Cas9、RNA干擾等）將該蛋白的表達(dá)水平顯著降低，然后用待檢抗體進(jìn)行標(biāo)記。如果得到陽(yáng)性減弱或消失的結(jié)果，說(shuō)明抗體標(biāo)記的正是該蛋白質(zhì)。采用該方法要注意兩個(gè)問(wèn)題。其一，針對(duì)基因的敲除或敲減操作不一定能馬上減少相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平。有的蛋白質(zhì)在生物樣本中可能有足量?jī)?chǔ)備，存在“緩沖池"；必須耗去這部分存量才能觀察到表達(dá)的下降。能否在允許的時(shí)間內(nèi)下調(diào)蛋白水平，是一個(gè)需要預(yù)試的問(wèn)題。其二，基因及相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平下調(diào)后，抗體標(biāo)記強(qiáng)度減弱，其實(shí)驗(yàn)證了抗體和該基因產(chǎn)物的“相關(guān)性"，但嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，還有可能標(biāo)記的并不是目標(biāo)蛋白質(zhì)。尚存在這樣的可能：抗體標(biāo)記的蛋白質(zhì)是與目標(biāo)蛋白有密切相互作用的另一種蛋白。比如，目標(biāo)蛋白減少后，抗體實(shí)際標(biāo)記的蛋白無(wú)從錨定（比如膜蛋白），進(jìn)而在標(biāo)本處理過(guò)程中流失，結(jié)果免疫標(biāo)記強(qiáng)度減弱。此時(shí)應(yīng)設(shè)計(jì)針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)來(lái)補(bǔ)充驗(yàn)證。
2、獨(dú)立抗體驗(yàn)證法。
同一目標(biāo)分子，可采用針對(duì)不同抗原決定簇的抗體來(lái)標(biāo)記。當(dāng)需要對(duì)某種蛋白分子進(jìn)行免疫標(biāo)記時(shí)，如果手中已有經(jīng)過(guò)特異性鑒定合格的其他抗體，且識(shí)別的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)與待檢抗體不同，那么原有抗體就可作為一個(gè)良好的陽(yáng)性參照。如果待檢抗體與原有的合格抗體具有相同的標(biāo)記結(jié)果，說(shuō)明待檢抗體的特異性是合格的。本法應(yīng)用時(shí)須注意蛋白分子亞型之間的區(qū)別。比如，待檢抗體與原有合格抗體的識(shí)別位點(diǎn)在有的亞型二者都存在，而有的亞型則可能缺少其中之一。結(jié)構(gòu)變化可能引起功能和分布的差別，此時(shí)本法就不能起到鑒定作用。
3、正交法。
正交法即采用互不影響的技術(shù)對(duì)抗體標(biāo)記的是否為目標(biāo)分子進(jìn)行鑒定的方法。比如要鑒定抗體是否能特異性標(biāo)記某蛋白質(zhì)，可通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)、色譜分離技術(shù)、針對(duì)生成該蛋白的RNA的原位雜交等，與抗體標(biāo)記一道進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。如果不同技術(shù)的檢測(cè)豐度/強(qiáng)度一致，說(shuō)明抗體的標(biāo)記具有特異性。采用該法時(shí)須注意各種技術(shù)自身的非特異性問(wèn)題，避免因參照技術(shù)本身的特異性缺陷而減弱鑒定結(jié)果的說(shuō)服力。
4、標(biāo)簽蛋白法。
可采用FLAG、V5等親和標(biāo)簽或GFP等熒光偶聯(lián)蛋白對(duì)待檢抗體進(jìn)行鑒定。如果抗親和標(biāo)簽的抗體標(biāo)記強(qiáng)度或熒光信號(hào)強(qiáng)度與待檢抗體的標(biāo)記強(qiáng)度一致，則說(shuō)明待檢抗體具有特異性。
特異性的選擇主要需要考慮四個(gè)方面：蛋白特異性、種屬特異性、實(shí)驗(yàn)方法特異性、標(biāo)記物的特異性。
1、蛋白特異性
針對(duì)需要檢測(cè)的蛋白查找抗體，幾個(gè)細(xì)節(jié)要區(qū)分：
a.重組蛋白如果不是全長(zhǎng)表達(dá)，則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。
b.內(nèi)源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式，特殊表型的蛋白需要進(jìn)行序列比對(duì)，并結(jié)合抗體免疫原序列，查看交叉反應(yīng)的情況。
c.磷酸化蛋白檢測(cè)需要確定具體位點(diǎn)，不同位點(diǎn)的磷酸化意味著可能有不同的機(jī)制存在，不宜一概而論。
2、種屬特異性
同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。
a.目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計(jì)多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng)。需要參照說(shuō)明書(shū)注明的可反應(yīng)種屬信息。
b.一些稀有種屬很難找到抗體，可以通過(guò)蛋白的序列比對(duì)，選擇同源序列免疫的抗體，不過(guò)一般這種情況生產(chǎn)商不會(huì)受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴，如果可以申請(qǐng)到免費(fèi)的抗體樣品，則利于抗體選擇。
3、實(shí)驗(yàn)方法特異性
目前使用抗體的實(shí)驗(yàn)方法有很多，不同的使用方法過(guò)程中，因?yàn)閷?duì)蛋白樣品的處理方式不一樣，蛋白的含量有差異，對(duì)抗體的識(shí)別表位和效價(jià)要求都是不一樣的。
4、標(biāo)記物的特異性
一般基于實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)方法不會(huì)使用帶有標(biāo)記的一抗，比如 WB、IHC 等，都是通過(guò)二抗類的試劑標(biāo)記達(dá)到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實(shí)驗(yàn)，可能就會(huì)使用到直接標(biāo)記的一抗，比如流式實(shí)驗(yàn)。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測(cè)到的熒光范圍，針對(duì)不通的參數(shù)要求選擇對(duì)應(yīng)的標(biāo)記物。在免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，需要選配不同的熒光標(biāo)記物。
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